蛋白浓度测定应该是每个生物人都要做的实验，BCA、Branford、Lowry法等各种蛋白定量试剂盒让人眼花缭乱，究竟该选那个呢？一起来看看。

BCA蛋白定量试剂盒

原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将其还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

实验过程：

1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50 体积BCA 试剂加1 体积Cu 试剂（50:1）配制成BCA 工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA 工作液室温24 小时内稳定。

2. 稀释标准品：取10 微升BSA 标准品用PBS 稀释至 100 微升（样品一般可用PBS 稀释），使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 微升加到 96 孔板的蛋白标准品孔中，加PBS 补足至20 微升。

3. 将样品作适当稀释，设置浓度梯度，加20 微升到96 孔板的样品孔中。

4. 各孔加入200 微升 BCA 工作液，37℃放置15-30 分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

Lowry法蛋白定量试剂盒

原理：在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，向该复合物中加入Folin-酚试剂后产生蓝色复合物。该蓝色复合物在650nm处的吸光度值与蛋白质的含量成正比，根据吸光度即可计算样品中的蛋白质含量。

Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比，Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

实验过程：

1. 根据需要量，取适量 Folin 酚甲试剂A 和B 按50:1 混合，混合后有效期为24 小时，过期失效。

2. 根据需要量，取适量 BSA 标准品用PBS 稀释稀释10 倍至浓度0.5mg/ml。

3. 将标准品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20ul 加到96 孔板中，加PBS 补足到20ul。

4. 将样品作适当稀释，加 20ul 到 96 孔板的样品孔中。

5. 将配好的 Folin 酚甲试剂每孔加入200ul，轻轻震动，混匀，室温放置10 分钟。

6. 各孔加入 20 微升Folin 酚乙试剂，迅速混匀，37℃放置30 分钟。用酶标仪测定A650， 计算蛋白浓度。

Bradford法蛋白定量试剂盒

原理：Bradford法，又被称为考马斯亮蓝G250比色法，是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝G250能与蛋白质通过疏水作用结合形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，吸光度值与蛋白质的含量成正比。

实验过程：

1. 完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul ，使终浓度为0.2mg/ml，可以用PBS稀释标准品。

2. 5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml 5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

3. 将标准品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20ul分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20ul。

4. 将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。

5. 各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。

6. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。

7. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

蛋白定量试剂盒特点对比