SE 2× qPCR SmArt Mix (SYBR Green) (No Rox)
产品描述
本产品是高灵敏型，采用SYBR Green I 嵌合荧光法进行的Real Time PCR专用试剂，组份中含有Real Time PCR反应中合适浓度的 SYBR Green I，是一种2×浓度的预混试剂，PCR反应液配制十分简单，使用时仅需加入模板、引物和ddH2O调至为1×即可。
本试剂中使用了抗Taq抗体修饰的Hot Start法DNA聚合酶，与优化的PCR Buffer组合，可以有效的抑制非特异扩增，提高PCR扩增效率，在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。
本产品为灵敏性较高的高敏型预混液，针对低拷贝数、低表达、低浓度体系，能够识别并高效利用模板进行目的基因的扩增，更稳定的检测低模板投入或低表达量基因。
产品组份
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
SE 2× qPCR SmArt Mix (SYBR Green) (No Rox)* | DY20306 | 5*1 mL |
*.包含dNTPs、Mg2+、HS-Taq DNA Polymerase、SYBR Green I等
保存条件
≤0℃运输， -30 ~ -15℃保存，有效期2年。
本产品避免反复冻融。产品中含有SYBR Green I 荧光染料，使用及保存时需注意避光。
产品特点
灵敏度高：可用于较低模板投入和低表达量基因的检测，有效提高的低拷贝数、低表达、低浓度体系的检测效率。
操作简单：操作简单、方便，可迅速完成定量PCR预混实验进行上机检测。
重复性好：重复组组内差异小，复孔孔间一致性高，具有较强重复性。
适用性强：已通过Roche LightCycler™系列和Bio-Rad CFX全系列荧光定量 PCR 系统进行验证，适配性高，数据准确。
应用范围广：用于DNA样本的定量扩增，可以扩增所有物种来源的DNA，样本类型可以是基因组DNA、cDNA、质粒DNA、λ DNA等。
质量控制
以Hela细胞总RNA的逆转录产物稀释液为模板，扩增不同基因，每个基因的融解曲线为单峰，特异性高，重复性好，扩增曲线在批次间的产品中相近。
操作说明
1.反应体系：(以ABI 7500机型为例)
组分 | 体积（50 μL） | 体积（20 μL） |
SE 2× qPCR SmArt Mix | 25 μL | 10 μL |
上游引物（10 μM） | 1 μL | 0.4 μL |
下游引物（10 μM） | 1 μL | 0.4 μL |
Template DNA | X μL | X μL |
ddH2O | 补足至50 μL | 补足至20 μL |
反应体系中各组分可以根据如下原则进行调整：
1）一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度0.1～1 μM范围内调整引物浓度。
2）qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
3）如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模版量以扩增得到的CT值在20-30左右。
2.反应程序设定：
1）两步法
Stage 1 | 预变性 | Reps: 1 | 95 °C | 3 min |
Stage 2 | 循环反应 | Reps: 40 | 95 °C | 10 sec |
60 °C * a | 30 sec | |||
Stage 3 | 溶解曲线** | Reps: 1 | 仪器默认设置 | |
2）三步法
Stage 1 | 预变性 | Reps: 1 | 95 °C | 3 min |
Stage 2 | 循环反应 | Reps: 40 | 95 °C | 10 sec |
60 °C a | 30 sec | |||
72 °C * | 20sec | |||
Stage 3 | 溶解曲线** | Reps: 1 | 仪器默认设置 | |
*：此步骤采集荧光信号。
**：仪器类型不同，溶解曲线采集程序不同，请使用仪器默认程序，95℃采集溶解曲线荧光信号。
a：根据引物的Tm值进行退火（退火/延伸）温度的设定。
常见问题与解决方案
1.扩增曲线形状异常
1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点（Ct值-4），重新分析数据。
3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2.反应结束无扩增曲线出现
反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩増程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72°C 延伸阶段。
确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
3.Ct值出现太晚
1）扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
2）模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3）模板降解：重新制备模板，重复实验。
4）PCR产物太长：推荐长度为80 bp~150 bp。
5）体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备模板重复实验。
4.阴性对照出现明显扩增
1）反应体系污染：更换新的Mix、水和引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶胶污染。
2）引物二聚体的出现：配合融解曲线进行分析。
5.绝对定量时标准曲线线性关系不佳
1）加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
2）标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
3）模板浓度太高：提高模板稀释倍数。
6.融解曲线出现多峰
1）引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。
2）引物浓度太高：适当降低引物浓度。
3）cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。
7.实验重复性差
1）加样体积失准：使用性能较好的移液器；将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
2）定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
3）模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
产品名称 | 产品编号 | 已测试机型 |
SP 2 × qPCR SmArt Mix (SYBR Green) (No Rox) | DY20307 | Bio-Rad CFX全系列 Roche LightCycler™系列 |
SE 2 × qPCR SmArt Mix (SYBR Green) (No Rox) | DY20306 |
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