超氧化物歧化酶SOD活性检测试剂盒(WST-1法)

Total Superoxide Dismutase Activity Assay Kit with WST-1

产品信息

产品描述

超氧化物歧化酶（SOD）能够催化超氧阴离子歧化，生成过氧化氢 (H₂O₂) 和单质氧气 (O₂)，是一种重要的抗氧化酶。WST-1法使用了易溶于水的噻唑盐：WST-1，能够和超氧阴离子反应生成水溶性的染料，因此可以简便地进行SOD的检测。WST-1的反应产物是稳定的水溶性产物，可以通过单个时间点的吸光度检测来测定SOD活力，适合高通量筛选研究。本试剂盒提供的SOD样品制备液能直接裂解细胞，无需匀浆，操作更加便捷。本试剂盒通过添加适量过氧化氢酶等特殊方法，能有效去除常规样品中过氧化氢的干扰。例如，对于SOD标准品的检测，标准品中添加高达0.1 mM的过氧化氢时，对于检测结果仍无显著影响。本试剂盒可以检测细胞或组织匀浆液上清、全血、红细胞抽提物、血清(浆)、胸水、腹水、肾透析液、尿液、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、各种动植物组织细胞级亚细胞等生物样品中的SOD活力。

产品组分

保存方式

-20℃避光保存，有效期1年。

操作步骤

1.样品的准备

a) 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，吸净细胞培养液，用4℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤一遍，按照每100万细胞加入100-200 μL的比例加入本试剂盒提供的SOD样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞；对于悬浮细胞，600 g离心5分钟收集细胞，用上述方法洗涤一遍，按上述比例加入SOD样品制备液，适当吹打，以充分裂解细胞。4℃约12,000 g离心3-5分钟，取上清作为待测样品。

b) 组织样品的准备：动物用生理盐水 (0.9% NaCl，含有0.16 mg/mL肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织样品，按照每10 mg组织加入100 μL SOD样品制备液的比例在4℃或冰浴进行匀浆。4℃约12,000 g离心3-5分钟，取上清作为待测样品。

c) 血浆或红细胞样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600 g离心10分钟，移取上清至另一新的1 mL离心管中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可以参考悬浮细胞样品的制备方法，或其它不含Triton X-100等去垢剂的样品制备方法。

d) 样品准备完毕后可以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。每种样品准备20-100 μg蛋白量就足够用于后续检测。

e) 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。样品若当天测定，则冰浴保存；否则可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。

2.试剂盒的准备工作

a) WST-1/酶工作液的配制：按照每个反应160 μL的体积配制适量的WST-1/酶工作液。均匀混合151 μL SOD检测缓冲液、8 μL WST-1和

1 μL酶溶液，即可配制成160 μL WST-1/酶工作液（可成比例放大）。根据待检测样品（包括标准品）的数量，配制适量的WST-1/酶工作液。配制好的WST-1/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。注意：使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。

b) 反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液 (40 x) 融解后混匀，按照每1 μL反应启动液 (40 x) 加入39 μL SOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待检测样品（包括标准品）的数量，配制适量的反应启动工作液。配制好的反应启动工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

c) (可选做)SOD标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的SOD样品制备液(当样品用试剂盒提供的SOD样品制备液制备时)或SOD检测缓冲液(当样品为血液等无需处理的样品时)将SOD标准品稀释至如下系列浓度：100 U/mL，50 U/mL，20 U/mL，10 U/mL，5 U/mL，2 U/mL，1 U/mL。在随后的检测中可以各取20 μL，参考样品进行检测。说明：SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。

3.样品测定

a) 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。

*如果样品有颜色或含有抗氧化物质，则需设置空白对照3；如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物则没有必要设置空白对照3。

b) 37℃孵育30分钟。说明：孵育25至35分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为保证检测结果的一致性，推荐孵育30分钟。

c) 在450 nm测定吸光度。如无450 nm滤光片，可以使用420-480 nm的滤光片。可以选择设定600 nm (或600 nm以上，如650 nm) 作为参比波长(也称参考波长)，450 nm吸光度的读数扣除参比波长的吸光度读数即可作为实测读数。

4.样品中总SOD活力的计算

a) 抑制百分率的计算：

参考如下计算公式计算抑制百分率：

抑制百分率(%)＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2) ×100%

如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物，则A空白对照2 = A空白对照3，此时可以把计算公式简化为如下形式(简化时可以不设置空白对照3)：抑制百分率 (%)＝(A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%

如果计算出来的抑制百分率小于30% 或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度较高的待测样品。

b) SOD酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(unit)。注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换算。

c) SOD酶活力的计算公式如下：

待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units

d) 如果样品为细胞或组织的匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。如果样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/g血红蛋白或U/mg血红蛋白。

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