异硫氰酸荧光素酯

Fluorescein 5-isothiocyanate（FITC）

产品信息

产品描述

FITC是一种有机荧光染料，最大吸收光波长为490～495 nm，最大发射光波长为520～530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC具有高吸收率、优良的荧光量子产率和良好的水溶性等特点，是生物学中应用最为广泛的一种绿色荧光素衍生物。FITC是生化试剂，也是医学诊断药物，主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学、农学和畜牧等方面，可对地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

保存方式

 2-8℃保存，有效期2年。

产品性质

CAS：   3326-32-7

分子式： C₂₁H₁₁NO₅S

分子量： 389.38

性状：   橘黄色粉末

溶解性： 5 mg/mL DMSO

纯度：   ≥90% (HPLC)

操作说明

标记蛋白

1）制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9.0）的待交联蛋白样品，浓度≥ 2 mg/mL。

注意：a）勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周，其pH值会发生变化，建议现配现用。

    b）待标记的蛋白必须是未被污染蛋白，且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。

2）溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液。于标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光。

3）对于1 mL 蛋白溶液加入50 µL FITC溶液，可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液。

4）待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8 h。

5）加入NH4Cl使其终浓度至50 mM，4℃终止反应2 h。

6）加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%。         

7）通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，分离范围在20000至50000（球蛋白例如抗体）。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是FITC-蛋白偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。

8）于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1 mg/mL），可加入1% BSA作为一种蛋白稳定剂。

9）偶联物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

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